第三代測(cè)序技術(shù)

　　第三代測(cè)序技術(shù)原理

　　第三代測(cè)序技術(shù)原理主要分為兩大技術(shù)陣營(yíng)：

　　第一大陣營(yíng)是單分子熒光測(cè)序，代表性的技術(shù)為美國(guó)螺旋生物(Helicos)的SMS技術(shù)和美國(guó)太平洋生物(Pacific Bioscience)的SMRT技術(shù)。脫氧核苷酸用熒光標(biāo)記，顯微鏡可以實(shí)時(shí)記錄熒光的強(qiáng)度變化。當(dāng)熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸被摻入DNA鏈的時(shí)候，它的熒光就同時(shí)能在DNA鏈上探測(cè)到。當(dāng)它與DNA鏈形成化學(xué)鍵的時(shí)候，它的熒光基團(tuán)就被DNA聚合酶切除，熒光消失。這種熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸不會(huì)影響DNA聚合酶的活性，并且在熒光被切除之后，合成的DNA鏈和天然的DNA鏈完全一樣。

　　第二大陣營(yíng)為納米孔測(cè)序，代表性的公司為英國(guó)牛津納米孔公司。新型納米孔測(cè)序法（nanopore sequencing）是采用電泳技術(shù)，借助電泳驅(qū)動(dòng)單個(gè)分子逐一通過(guò)納米孔 來(lái)實(shí)現(xiàn)測(cè)序的。由于納米孔的直徑非常細(xì)小，僅允許單個(gè)核酸聚合物通過(guò)，而ATCG單個(gè)堿基的帶電性質(zhì)不一樣，通過(guò)電信號(hào)的差異就能檢測(cè)出通過(guò)的堿基類(lèi)別，從而實(shí)現(xiàn)測(cè)序。

　　第三代測(cè)序技術(shù)解決關(guān)鍵技術(shù)

　　第一：因?yàn)樵陲@微鏡實(shí)時(shí)記錄DNA鏈上的熒光的時(shí)候，DNA鏈周?chē)谋姸嗟臒晒鈽?biāo)記的脫氧核苷酸形成了非常強(qiáng)大的熒光背景。這種強(qiáng)大的熒光背景使單分子的熒光探測(cè)成為不可能。Pacific Biosciences公司發(fā)明了一種直徑只有幾十納米的納米孔[zero-mode waveguides (ZMWs)]，單分子的DNA聚合酶被固定在這個(gè)孔內(nèi)。在這么小的孔內(nèi)，DNA鏈周?chē)臒晒鈽?biāo)記的脫氧核苷酸有限，而且由于A，T，C，G這四種熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸非?？焖俚貜耐饷孢M(jìn)入到孔內(nèi)又出去，它們形成了非常穩(wěn)定的背景熒光信號(hào)。而當(dāng)某一種熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸被摻入到DNA鏈時(shí)，這種特定顏色的熒光會(huì)持續(xù)一小段時(shí)間，直到新的化學(xué)鍵形成，熒光基團(tuán)被DNA聚合酶切除為止。

　　第二：共聚焦顯微鏡實(shí)時(shí)地快速地對(duì)集成在板上的無(wú)數(shù)的納米小孔同時(shí)進(jìn)行記錄。

　　第三代測(cè)序技術(shù)特點(diǎn)

　　1、它實(shí)現(xiàn)了DNA聚合酶內(nèi)在自身的反應(yīng)速度，一秒可以測(cè)10個(gè)堿基，測(cè)序速度是化學(xué)法測(cè)序的2萬(wàn)倍。

　　2、它實(shí)現(xiàn)了DNA聚合酶內(nèi)在自身的延續(xù)性，一個(gè)反應(yīng)就可以測(cè)非常長(zhǎng)的序列。二代測(cè)序現(xiàn)在可以測(cè)到上百個(gè)堿基，但是三代測(cè)序現(xiàn)在就可以測(cè)幾千個(gè)堿基。

　　3、它的精度非常高，達(dá)到99.9999%。

　　4、直接測(cè)RNA的序列。既然DNA聚合酶能夠?qū)崟r(shí)觀測(cè)，那么以RNA為模板復(fù)制DNA的逆轉(zhuǎn)錄酶也同樣可以。RNA的直接測(cè)序，將大大降低體外逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的系統(tǒng)誤差。

　　5、第二個(gè)是直接測(cè)甲基化的DNA序列。實(shí)際上DNA聚合酶復(fù)制A、T、C、G的速度是不一樣的。正常的C或者甲基化的C為模板，DNA聚合酶停頓的時(shí)間不同。根據(jù)這個(gè)不同的時(shí)間，可以判斷模板的C是否甲基化。

　　第三代測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用

　　基因組測(cè)序

　　由于具有讀長(zhǎng)長(zhǎng)的特點(diǎn)，SMRT測(cè)序平臺(tái)在基因組測(cè)序中能降低測(cè)序后的Contig數(shù)量，明顯減少后續(xù)的基因組拼接和注釋的工作量，節(jié)省大量的時(shí)間[25]。Christophern等[26]僅僅用0.5*的Pacbio RS系統(tǒng)長(zhǎng)度的數(shù)據(jù)與38*的二代測(cè)序(NGS)的測(cè)序數(shù)據(jù)，對(duì)馬達(dá)加斯加的一種指猴基因組進(jìn)行拼裝，大幅度提高了數(shù)據(jù)的質(zhì)量和完整度，同時(shí)借助Pacbio RS的幫助將原有的Contig數(shù)量減少了10倍。DavidA．等利用Pachio RS平臺(tái)C2試劑通過(guò)全球合作幾天內(nèi)就完成了從德國(guó)大腸桿菌疫情中獲得的大腸桿菌樣品以及近似菌株的測(cè)序和數(shù)據(jù)分析，最終獲得了2900bp的平均讀長(zhǎng)以及99.998%的一致性準(zhǔn)確度。在對(duì)霍亂病菌的研究中，第三代測(cè)序技術(shù)已初現(xiàn)鋒芒。研究人員對(duì)5株霍亂菌株的基因組進(jìn)行了測(cè)序研究，并與其他23株霍亂弧菌的基因組進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果發(fā)現(xiàn)海地霍亂菌株與2002年和2008年在孟加拉國(guó)分離得到的變異霍亂弧菌ElTorO1菌株之間關(guān)系密切，而與1991年拉丁美洲霍亂分離株的關(guān)系較遠(yuǎn)。相對(duì)NGS的優(yōu)勢(shì)就是能更快獲得結(jié)果，因此該系統(tǒng)在鑒定新的病原體和細(xì)菌的基因組測(cè)序方面得到很廣泛的應(yīng)用。

　　甲基化研究

　　SMRT技術(shù)采用的是對(duì)DNA聚合酶的工作狀態(tài)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的方法，聚合酶合成每一個(gè)堿基，都有一個(gè)時(shí)間段，而當(dāng)模板堿基帶有修飾時(shí)，聚合酶會(huì)慢下來(lái)，使帶有修飾的堿基兩個(gè)相鄰的脈沖峰之間的距離和參考序列的距離之間的比值如果大于1，由此就可以推斷這個(gè)位置有修飾。甲基化研究中關(guān)于5瞞C和5瞙mC（5瞞C的羥基化形式）是甲基化研究中的熱點(diǎn)。但現(xiàn)有的測(cè)序方法無(wú)法區(qū)分5瞞C和5瞙mC。美國(guó)芝加哥大學(xué)利用SMRT測(cè)序技術(shù)和5瞙mC的選擇性化學(xué)標(biāo)記方法來(lái)高通量檢測(cè)5瞙mC。通過(guò)聚合酶動(dòng)力學(xué)提供的信息，可直接檢測(cè)到DNA甲基化，包括N6布諄腺嘌呤、5瞞C和5瞙mC，為表觀遺傳學(xué)研究打開(kāi)了一條通路。

　　突變鑒定（SNP檢測(cè)）

　　單分子測(cè)序的分辨率具有不可比擬的優(yōu)勢(shì)，而且沒(méi)有PCR擴(kuò)增步驟，就沒(méi)有擴(kuò)增引入的堿基錯(cuò)誤，該優(yōu)勢(shì)使其在特定序列的SNP檢測(cè)，稀有突變及其頻率測(cè)定中大顯身手。例如在醫(yī)學(xué)研究中，對(duì)于FLT3基因是否是急性髓細(xì)胞白血?。ˋML）的有效治療靶標(biāo)一直存在質(zhì)疑。研究人員用單分子測(cè)序分析耐藥性患者基因，意外發(fā)現(xiàn)耐藥性與FLT3基因下游出現(xiàn)的稀有新突變有關(guān)，重新證明了FLT3基因是這種最常見(jiàn)白血病—急性髓細(xì)胞白血?。ˋML）的有效治療靶標(biāo)，打破了一直以來(lái)對(duì)于這一基因靶標(biāo)的疑惑。憑借PacBio平均3000bp的讀長(zhǎng)，獲得了更多基因下游的寶貴信息，而基于單核酸分子的測(cè)序能夠檢測(cè)到低頻率（低至1%）罕見(jiàn)突變，正是這項(xiàng)成果的關(guān)鍵所在。