第三代測序技術(shù)

　　第三代測序技術(shù)原理

　　第三代測序技術(shù)原理主要分為兩大技術(shù)陣營：

　　第一大陣營是單分子熒光測序，代表性的技術(shù)為美國螺旋生物(Helicos)的SMS技術(shù)和美國太平洋生物(Pacific Bioscience)的SMRT技術(shù)。脫氧核苷酸用熒光標(biāo)記，顯微鏡可以實(shí)時(shí)記錄熒光的強(qiáng)度變化。當(dāng)熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸被摻入DNA鏈的時(shí)候，它的熒光就同時(shí)能在DNA鏈上探測到。當(dāng)它與DNA鏈形成化學(xué)鍵的時(shí)候，它的熒光基團(tuán)就被DNA聚合酶切除，熒光消失。這種熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸不會(huì)影響DNA聚合酶的活性，并且在熒光被切除之后，合成的DNA鏈和天然的DNA鏈完全一樣。

　　第二大陣營為納米孔測序，代表性的公司為英國牛津納米孔公司。新型納米孔測序法（nanopore sequencing）是采用電泳技術(shù)，借助電泳驅(qū)動(dòng)單個(gè)分子逐一通過納米孔 來實(shí)現(xiàn)測序的。由于納米孔的直徑非常細(xì)小，僅允許單個(gè)核酸聚合物通過，而ATCG單個(gè)堿基的帶電性質(zhì)不一樣，通過電信號(hào)的差異就能檢測出通過的堿基類別，從而實(shí)現(xiàn)測序。

　　第三代測序技術(shù)解決關(guān)鍵技術(shù)

　　第一：因?yàn)樵陲@微鏡實(shí)時(shí)記錄DNA鏈上的熒光的時(shí)候，DNA鏈周圍的眾多的熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸形成了非常強(qiáng)大的熒光背景。這種強(qiáng)大的熒光背景使單分子的熒光探測成為不可能。Pacific Biosciences公司發(fā)明了一種直徑只有幾十納米的納米孔[zero-mode waveguides (ZMWs)]，單分子的DNA聚合酶被固定在這個(gè)孔內(nèi)。在這么小的孔內(nèi)，DNA鏈周圍的熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸有限，而且由于A，T，C，G這四種熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸非常快速地從外面進(jìn)入到孔內(nèi)又出去，它們形成了非常穩(wěn)定的背景熒光信號(hào)。而當(dāng)某一種熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸被摻入到DNA鏈時(shí)，這種特定顏色的熒光會(huì)持續(xù)一小段時(shí)間，直到新的化學(xué)鍵形成，熒光基團(tuán)被DNA聚合酶切除為止。

　　第二：共聚焦顯微鏡實(shí)時(shí)地快速地對集成在板上的無數(shù)的納米小孔同時(shí)進(jìn)行記錄。

　　第三代測序技術(shù)特點(diǎn)

　　1、它實(shí)現(xiàn)了DNA聚合酶內(nèi)在自身的反應(yīng)速度，一秒可以測10個(gè)堿基，測序速度是化學(xué)法測序的2萬倍。

　　2、它實(shí)現(xiàn)了DNA聚合酶內(nèi)在自身的延續(xù)性，一個(gè)反應(yīng)就可以測非常長的序列。二代測序現(xiàn)在可以測到上百個(gè)堿基，但是三代測序現(xiàn)在就可以測幾千個(gè)堿基。

　　3、它的精度非常高，達(dá)到99.9999%。

　　4、直接測RNA的序列。既然DNA聚合酶能夠?qū)崟r(shí)觀測，那么以RNA為模板復(fù)制DNA的逆轉(zhuǎn)錄酶也同樣可以。RNA的直接測序，將大大降低體外逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的系統(tǒng)誤差。

　　5、第二個(gè)是直接測甲基化的DNA序列。實(shí)際上DNA聚合酶復(fù)制A、T、C、G的速度是不一樣的。正常的C或者甲基化的C為模板，DNA聚合酶停頓的時(shí)間不同。根據(jù)這個(gè)不同的時(shí)間，可以判斷模板的C是否甲基化。

　　第三代測序技術(shù)的應(yīng)用

　　基因組測序

　　由于具有讀長長的特點(diǎn)，SMRT測序平臺(tái)在基因組測序中能降低測序后的Contig數(shù)量，明顯減少后續(xù)的基因組拼接和注釋的工作量，節(jié)省大量的時(shí)間[25]。Christophern等[26]僅僅用0.5*的Pacbio RS系統(tǒng)長度的數(shù)據(jù)與38*的二代測序(NGS)的測序數(shù)據(jù)，對馬達(dá)加斯加的一種指猴基因組進(jìn)行拼裝，大幅度提高了數(shù)據(jù)的質(zhì)量和完整度，同時(shí)借助Pacbio RS的幫助將原有的Contig數(shù)量減少了10倍。DavidA．等利用Pachio RS平臺(tái)C2試劑通過全球合作幾天內(nèi)就完成了從德國大腸桿菌疫情中獲得的大腸桿菌樣品以及近似菌株的測序和數(shù)據(jù)分析，最終獲得了2900bp的平均讀長以及99.998%的一致性準(zhǔn)確度。在對霍亂病菌的研究中，第三代測序技術(shù)已初現(xiàn)鋒芒。研究人員對5株霍亂菌株的基因組進(jìn)行了測序研究，并與其他23株霍亂弧菌的基因組進(jìn)行對比。結(jié)果發(fā)現(xiàn)海地霍亂菌株與2002年和2008年在孟加拉國分離得到的變異霍亂弧菌ElTorO1菌株之間關(guān)系密切，而與1991年拉丁美洲霍亂分離株的關(guān)系較遠(yuǎn)。相對NGS的優(yōu)勢就是能更快獲得結(jié)果，因此該系統(tǒng)在鑒定新的病原體和細(xì)菌的基因組測序方面得到很廣泛的應(yīng)用。

　　甲基化研究

　　SMRT技術(shù)采用的是對DNA聚合酶的工作狀態(tài)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測的方法，聚合酶合成每一個(gè)堿基，都有一個(gè)時(shí)間段，而當(dāng)模板堿基帶有修飾時(shí)，聚合酶會(huì)慢下來，使帶有修飾的堿基兩個(gè)相鄰的脈沖峰之間的距離和參考序列的距離之間的比值如果大于1，由此就可以推斷這個(gè)位置有修飾。甲基化研究中關(guān)于5瞞C和5瞙mC（5瞞C的羥基化形式）是甲基化研究中的熱點(diǎn)。但現(xiàn)有的測序方法無法區(qū)分5瞞C和5瞙mC。美國芝加哥大學(xué)利用SMRT測序技術(shù)和5瞙mC的選擇性化學(xué)標(biāo)記方法來高通量檢測5瞙mC。通過聚合酶動(dòng)力學(xué)提供的信息，可直接檢測到DNA甲基化，包括N6布諄腺嘌呤、5瞞C和5瞙mC，為表觀遺傳學(xué)研究打開了一條通路。

　　突變鑒定（SNP檢測）

　　單分子測序的分辨率具有不可比擬的優(yōu)勢，而且沒有PCR擴(kuò)增步驟，就沒有擴(kuò)增引入的堿基錯(cuò)誤，該優(yōu)勢使其在特定序列的SNP檢測，稀有突變及其頻率測定中大顯身手。例如在醫(yī)學(xué)研究中，對于FLT3基因是否是急性髓細(xì)胞白血?。ˋML）的有效治療靶標(biāo)一直存在質(zhì)疑。研究人員用單分子測序分析耐藥性患者基因，意外發(fā)現(xiàn)耐藥性與FLT3基因下游出現(xiàn)的稀有新突變有關(guān)，重新證明了FLT3基因是這種最常見白血病—急性髓細(xì)胞白血?。ˋML）的有效治療靶標(biāo)，打破了一直以來對于這一基因靶標(biāo)的疑惑。憑借PacBio平均3000bp的讀長，獲得了更多基因下游的寶貴信息，而基于單核酸分子的測序能夠檢測到低頻率（低至1%）罕見突變，正是這項(xiàng)成果的關(guān)鍵所在。